1、安装，加载所用到到R包

用BiocManager安装，可同时加载依赖包

source("https://bioconductor.org/biocLite.R")

BiocManager::install("clusterProfiler")

library(clusterProfiler) ##富集分析
library(topGO) ###画GO图
library(AnnotationHub) ##获取数据库
library(BiocFileCache) ##依赖包
library(dbplyr) ##依赖包
library(pathview) ##看KEGG pathway

2、利用annotataionHub去抓取目标orgDb

ah <- AnnotationHub()  ##收索所有orgdb，到ah

unique(ah$dataprovider) ##可查看数据注释来源

query(ah, "Apis cerana")  ##查找目标物种

tar_org <- ah[["AH62635"]] ##下载目标物种到org数据

3、了解org数据库

主要有5个函数

columns(x)： 显示当前对象有哪些数据
keytypes(x)： 有哪些keytypes可以用作select或keys的keytypes参数
keys(x, keytype, ...)：返回当前数据对象的keys
select(x, keys, columns, keytype, ...)：基于keys, columns和keytype以data.frame数据类型返回数据，可以是一对多的关系
mapIds(x, keys, column, keytype, ..., multiVals)： 类似于select，只不过就返回一个列。

3.1 以symbol形式展示

head(keys(tar_org,keytype = "SYMBOL"),30)  ##默认为ENTREZID

3.2、可以查看gene类型

keytypes(tar_org)
 [1] "ARACYC"       "ARACYCENZYME" "ENTREZID"     "ENZYME"       "EVIDENCE"     "EVIDENCEALL"  "GENENAME"    
 [8] "GO"           "GOALL"        "ONTOLOGY"     "ONTOLOGYALL"  "PATH"         "PMID"         "REFSEQ"      
[15] "SYMBOL"       "TAIR" 

3.3、select则是根据你提供的key值去查找注释数据库，返回你需要的columns信息

> select(tar_org, keys= "AGO1", columns=c("TAIR","GO"),keytype = "SYMBOL")
\'select()\' returned 1:many mapping between keys and columns
   SYMBOL      TAIR         GO EVIDENCE ONTOLOGY
1    AGO1 AT1G48410 GO:0004521      IDA       MF
2    AGO1 AT1G48410 GO:0005515      IPI       MF
3    AGO1 AT1G48410 GO:0005634      IDA       CC
4    AGO1 AT1G48410 GO:0005737      IDA       CC
5    AGO1 AT1G48410 GO:0005737      ISM       CC
6    AGO1 AT1G48410 GO:0005737      TAS       CC
7    AGO1 AT1G48410 GO:0005829      IDA       CC
8    AGO1 AT1G48410 GO:0006306      RCA       BP
9    AGO1 AT1G48410 GO:0006342      RCA       BP
10   AGO1 AT1G48410 GO:0006346      RCA       BP

⚠️找到差异基因后，必须得确定你得基因号是对应ENTREZID 或者SYMBOL，，是属于哪种类型，若没有符合上述类型，可自行找到NCBI上得数据名称，进行blast更换名字。

4、进行作图

统一将差异基因名字改为ENTREZID，防止在做GO分析的时候出现报错，需要将symbolID转换成ENTREZID：用mapIds函数就可以转换ID。

DEG.entrez_id = mapIds(x = tar_org,               #### 数据库
                       keys = DEG.gene_symbol,    #####差异基因名字
                       keytype = "SYMBOL",        ####差异基因类型是SYMBOL
                       column = "ENTREZID")       #####转换为ENTREZID

 这时就已经把symbolID转换成ENTREZID了，但会出现个别的转换不成功的情况，就是图中NA的地方，我们进行以下操作即可去掉：

DEG.entrez_id = na.omit(DEG.entrez_id)

4.1、GO分析代码

BP（Biological process）层面上的富集分析：

erich.go.BP = enrichGO(gene = DEG.entrez_id,      ###差异基因ID
                       OrgDb = tar_org,           ###数据库
                       keyType = "ENTREZID",       ##基因ID类型
                       ont = "BP",                 ##对BP进行GO分析
                       pvalueCutoff = 0.5,         ###fisher检验对p值
                       qvalueCutoff = 0.5)         ###对p值进行校对对q值，一般大于p值

作图：

dotplot(erich.go.BP)

解读BP层面富集分析图：
横坐标是GeneRatio，意思是说输入进去的基因，它每个term（纵坐标）站整体基因的百分之多少。圆圈的大小代表基因的多少，图中给出了最大的圆圈代表60个基因，圆圈的颜色代表P-value，也就是说P-value越小gene count圈越大，这事就越可信。

也可以画柱形图

barplot(erich.go.CC)

 一般GO分析画这两个图就可以了，有时也把GO分析画成树形图，可以更加帮助我们理解。

plotGOgraph(erich.go.BP)

树状图很大，所以我们用代码把它存成pdf，学习下如何用代码 

pdf(file="./enrich.go.bp.tree.pdf",width = 10,height = 15)
plotGOgraph(erich.go.BP)
dev.off()
至此，GO分析就做完了 ----> over


4.2、KEGG pathway 介绍
KEGG pathway是最常用的功能注释数据库之一，可以利用KEGG 的API获取一个物种所有基因对应的pathway注释，human对应的API 链接如下

http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway      人类
http://rest.kegg.jp/link/soe/pathway      菠菜

path:hsa00010 hsa:10327
path:hsa00010 hsa:124
path:hsa00010 hsa:125

第一列为pathway编号，第二列为基因编号。这里只提供了pathway编号，我们还需要pathway对应的描述信息，同样也可以通过以下API链接得到
http://rest.kegg.jp/list/
通过该链接可以获得如下内容

path:map00010 Glycolysis / Gluconeogenesis
path:map00020 Citrate cycle (TCA cycle)
path:map00030 Pentose phosphate pathway
path:map00040 Pentose and glucuronate interconversions
path:map00051 Fructose and mannose metabolism

第一列为pathway编号，第二列为具体的描述信息。需要注意的是，pathway是一个跨物种的概念，原始的pathway编号为map或者ko加数字，对于特定物种，改成物种对应的三字母缩写, 比如human对应hsa, 所有拥有pathway信息的物种和对应的三字母缩写见如下链接

https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html

clusterProfiler也是通过KEGG API去获取物种对应的pathway注释，对于已有pathway注释的物种，我们只需要知道对应的三字母缩写， clusterProfiler就会联网自动获取该物种的pathway注释信息。

和GO富集分析类似，对于KEGG的富集分析也包含以下两种

• 过表征分析 (over representation analysis, ORA)        ###先会筛选，并挑选出我们感兴趣对基因

• 基因富集分析 (gene set enrichment analysis, GSEA)       ###不进行筛选

 enrich.KEGG.BP <- enrichKEGG(gene = test_sample,                #### 差异基因ID  ENTREZID

　　　　　　　　　　　　　　　　keyType = "kegg",                    ####key类型

　　　　　　　　　　　　　　　　organism = "soe",                     ###物种3字母

　　　　　　　　　　　　　　　　pvalueCutoff = 0.05,                

                                                pAdjustMethod = "BH",

　　　　　　　　　　　　　　　　 qvalueCutoff = 0.1,)

4.2.1、柱状图

barplot(enrich.KEGG.BP, showCategory = 10)

 横轴为该pathway的差异基因个数，纵轴为富集到的pathway的描述信息， showCategory指定展示的pathway的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。注意的颜色对应p.adjust值，从小到大，对应蓝色到红色。

4.2.2、点图

dotplot(enrich.KEGG.BP, showCategory = 10)

横轴为GeneRatio, 代表该pathway下的差异基因个数占差异基因总数的比例，纵轴为富集到的pathway的描述信息， showCategory指定展示的pathway的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。图中点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色，大小对应该GO terms下的差异基因个数，个数越多，点越大。
 

4.2.3、Gene-Concept Network

前面的 两款神器 两个函数，都只能展示富集最显著的 GO term，而函数 cnetplot() 可以将基因与生物学概念 (e.g.* GO terms or KEGG pathways) 的关系绘制成网状图。对于基因和富集的pathways之间的对应关系进行展示，如果一个基因位于一个pathway下，则将该基因与pathway连线，用法如下

cnetplot(enrich.KEGG.BP, showCategory = 5)

 图中灰色的点代表基因，黄色的点代表富集到的pathways, 默认画top5富集到的pathwayss, pathways节点的大小对应富集到的基因个数。数字就是基因ID，如果需要更换，可以更换keytype，或者直接在enrich.KEGG.BP 的结果中进行相同ID更换

cnetplot(enrich.KEGG.BP,circular=T,  ###画为圈图

                         colorEdge=T)      ##线条用颜色区分

4.2.4、Enrichment Map

Enrichment Map 可以将富集条目和重叠的基因集整合为一个网络图，相互重叠的基因集则趋向于成簇，从而易于分辨功能模型。对于富集到的pathways之间的基因重叠关系进行展示，如果两个pathway的差异基因存在重叠，说明这两个节点存在overlap关系，在图中用线条连接起来，用法如下

emapplot(enrich.KEGG.BP)

每个节点是一个富集到的pathway, 默认画top30个富集到的pathways, 节点大小对应该pathway下富集到的差异基因个数，节点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色。

 4.2.5 browseKEGG

browseKEGG(enrich.KEGG.BP,"soe00564")    ###画出某一特定pathway的图

关于KEGG解释，可以查看链接