以下文章来源于简书，作者 biobin，文章已获原作者授权。

前言

关于 clusterProfiler这个 R 包就不介绍了，网红教授宣传得很成功，功能也比较强大，主要是做 GO 和 KEGG 的功能富集及其可视化。简单总结下用法，以后用时可直接找来用。

首先考虑一个问题： clusterProfiler做 GO 和 KEGG 富集分析的注释信息来自哪里？

GO 的注释信息来自 Bioconductor，提供了19个物种的 org 类型的 GO 注释信息，如下表所示。Bioconductor 中更多的注释包可参考下面这个链接，很乱，大多数我都不知道干啥用的。

• http : //w ww.bioconductor.org/packages/release/data/annotation/

KEGG 的注释信息 clusterProfiler通过 KEGG 数据库的 API 来获取， https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html。

首先是一个物种所有基因对应的 pathway 注释文件，比如人的：http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway。

其次还需要 pathway 的描述信息，比如人的：http://rest.kegg.jp/list/pathway/hsa。

关于 KEGG 数据库全部的物种及其简写（三个字母）如下列表（部分截图）：

因此对于以上已有 pathway 注释的物种，只需要将物种简写输入给clusterProfiler， 它会通过联网自动获取该物种的 pathway 注释信息。

以上都是有物种信息的情况，那么对于无物种信息的项目怎么办？

GO 可以通过读取外部的 GO 注释文件进行分析。关于基因的 GO 注释，interproscan、eggnog-mapper和blas2go等软件都可以做，不过输出格式有些不同。clusterProfiler需要导入的 GO 注释文件的格式如下：

需要包含以上三列信息，这 3 列信息任意顺序都可。

clusterProfiler包只针对含有 OrgDb 对象，如果是公共数据库中有该物种注释信息，只是未制作成 org.db 数据库（标准注释库），则可以不需要从头注释，只需手动制作 org.db 数据库类型，完成后直接使用即可，代码如下：

source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("AnnotationHub") # 一个包含大量注释信息的数据库，里面有很多物种及来源于很多数据库的注释信息。
BiocManager::install("biomaRt")

library(AnnotationHub) 
library(biomaRt)

hub <- AnnotationHub() # 建立AnnotationHub对象（视人品，网不行加载不了）
# unique(hub$species) # 查看AnonotationHub里面物种
hub$species[which(hub$species=="Solanum")] # 看AnonotationHub里是否包含想要的物种
# Solanum是番茄的拉丁名
query(hub, "Solanum")  # 查看该物种信息
hub[hub$species=="Solanum" & hub$rdataclass == "OrgDb"] # OrgDb属于rdataclass中，因此查看下该物种有没有OrgDb
Solanum.OrgDb <- hub[["AH59087"]] # AH59087是番茄对应的编号
# 制作为标准注释库，就可和模式生物一样使用了

同样地，对于 pathway 数据库中没有的物种，也支持读取基因的 pathway 注释文件，然后进行分析，注释文件的格式如下：

富集分析

通常用的富集分析有 ORA、FCS 和拓扑三种方法。ORA 简单来说就是超几何检验或 Fisher 精确检验，大同小异，都符合超几何检验，这也是目前用的最多的方法，优劣不谈。FCS 的代表就是 GSEA，即基因集富集分析，优劣亦不谈。clusterProfiler提供了这两种富集分析方法。

1. ORA(Over-Representation Analysis)

GO 富集参考代码：

#标准富集分析
ego <- enrichGO(
          gene  = gene$entrzID,
          keyType = "ENTREZID", 
          universe = names(geneList), #背景基因集，可省
          OrgDb   = org.Hs.eg.db,
          ont     = "CC",
          pAdjustMethod = "BH",
          pvalueCutoff  = 0.01,
          qvalueCutoff  = 0.05,
          readable      = TRUE)

#通过导入外部注释文件富集分析
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

一些参数说明：

• gene：差异基因对应的向量；

• keyType：指定基因ID的类型，默认为 ENTREZID, 可参考keytypes(org.Hs.eg.db)类型 ；

• OrgDb：指定该物种对应的 org 包的名字；

• ont：代表 GO 的 3 大类别，BP，CC，MF，也可是全部 ALL；

• pAdjustMethod：指定多重假设检验矫正的方法，有"holm"，"hochberg"，"hommel"，"bonferroni"，"BH"，"BY"，"fdr"，"none"中的一种；

• cufoff：指定对应的阈值；

• readable=TRUE：代表将基因 ID 转换为 gene symbol。

KEGG Pathway 富集参考代码：

    
    
    #标准富集分析
 
     
     
     
ego <- enrichKEGG(
 
     
     
     
          gene = gene,
 
     
     
     
          keyType = 
 
     
     
     "kegg",
 
     
     
     
          organism  = 
 
     
     
     \'hsa\',
 
     
     
     
          pvalueCutoff  = 
 
     
     
     0.05,
 
     
     
     
          pAdjustMethod  = 
 
     
     
     "BH",
 
     
     
     
          qvalueCutoff  = 
 
     
     
     0.05
 
     
     
     
)
 
     
     
     


#通过外部导入注释文件富集
 
     
     
     
data <- read.table(
 
     
     
     "pathway_annotation.txt",header = 
 
     
     
     T,sep = 
 
     
     
     "\t")
 
     
     
     
go2gene <- data[, c(
 
     
     
     2, 
 
     
     
     1)]
 
     
     
     
go2name <- data[, c(
 
     
     
     2, 
 
     
     
     3)]
 
     
     
     
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)
 
     
     
     

• 默认基因 ID 为 kegg gene id，也可以是 ncbi-geneid，ncbi-proteinid，uniprot 等。

• organism 物种对应的三字母缩写，其他参数同 GO 富集。

ID 转换函数：

library(clusterProfiler)
bitr_kegg("1",fromType = "kegg",toType = \'ncbi-proteinid\',organism=\'hsa\')

library(org.Hs.eg.db)
keytypes(org.Hs.eg.db) #支持的ID类型
bitr(gene, fromType = "ENTREZID", toType = c("ENSEMBL", "SYMBOL"), OrgDb = org.Hs.eg.db)

#以上看出ID转换输入时，可以向量的形式，也可以单列基因名list导入，也可以是内置数据
gene <- c("AASDH","ABCB11","ADAM12","ADAMTS16","ADAMTS18")
gene  <-  data$V1 #字符串

data(geneList, package="DOSE") #富集分析的背景基因集
gene <- names(geneList)[abs(geneList) > 2]

2. GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)

GO 富集参考代码：

#标准富集分析
ego <- gseGO(
      geneList  = geneList,
      OrgDb  = org.Hs.eg.db,
      ont  = "CC",
      nPerm  = 1000,  #置换检验的置换次数
      minGSSize  = 100,
      maxGSSize  = 500,
      pvalueCutoff = 0.05,
      verbose  = FALSE)

#通过导入外部注释文件富集分析参考代码：
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

KEGG Pathway 富集参考代码：

#标准富集分析
kk <- gseKEGG(
  geneList  = gene,
  keyType  = \'kegg\',
  organism = \'hsa\',
  nPerm  = 1000,
  minGSSize = 10,
  maxGSSize = 500,
  pvalueCutoff = 0.05,
  pAdjustMethod     = "BH"
)

#通过外部导入注释文件富集
data <- read.table("pathway_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

可视化

1. GO 富集分析结果可视化

#barplot
barplot(ego, showCategory = 10) #默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个

#dotplot
dotplot(ego, showCategory = 10)

#DAG有向无环图
plotGOgraph(ego)  #矩形代表富集到的top10个GO terms, 颜色从黄色过滤到红色，对应p值从大到小。

#igraph布局的DAG
goplot(ego)

#GO terms关系网络图（通过差异基因关联）
emapplot(ego, showCategory = 30)

#GO term与差异基因关系网络图
cnetplot(ego, showCategory = 5)

2. Pathway 富集分析结果可视化

#barplot
barplot(kk, showCategory = 10)

#dotplot
dotplot(kk, showCategory = 10)

#pathway关系网络图（通过差异基因关联）
emapplot(kk,  showCategory = 30)

#pathway与差异基因关系网络图
cnetplot(kk, showCategory = 5)

#pathway映射
browseKEGG(kk, "hsa04934") #在pathway通路图上标记富集到的基因，会链接到KEGG官网

— END—

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